BeaverBeads™ 人CD3+ T细胞分选试剂盒

本产品可以通过阴性分选法从人外周血单个核细胞(PBMC)中分离出CD3+ T细胞。原理是选用生 物素(biotin)标记的单克隆抗体对非目标细胞(非CD3+ T细胞)进行标记，然后通过链霉亲和素 (streptavidin)标记的磁珠对非目标细胞进行清除，从而达到人外周血CD3+ T细胞分选的目的。分 选过程需要用到磁力架。 

2-8°C保存，不可冷冻，有效期见试管标签。

本试剂盒适用于从人PBMC中分选出CD3+ T细胞。

1. 制备人PBMC：利用Ficoll密度梯度离心法从人外周血中分离PBMC，收集PBMC，以PBS洗涤细胞，离心后将PBMC重悬于分选buffer中，调整细胞密度为1×108 cells/ml。

注意：分选buffer为含有2 mM EDTA和2% 胎牛血清(FBS)的PBS或者含有2 mM EDTA和0.5%BSA的PBS，需预先通过0.22 μm滤膜过滤除菌。
2. 将100 μl 细胞悬液(1×107个细胞)加入无菌流式管底部，再加入10 μl Biotin-Antibody Mix，混匀后4°C孵育10 min。

注意：加入细胞悬液时将细胞加入流式管底部，避免沿流式管管壁加入。根据所使用磁力架不同也可使用离心管进行细胞分选。如果分选更多细胞，则按比例增加Biotin-Antibody Mix的用量。

3.孵育完成后，在流式管中加入30 μl 清洗过的BeaverBeads® Streptavidin(磁珠使用前需要用分选buffer进行清洗：涡旋振荡重悬磁珠，吸取实验需要的磁珠至1.5 ml离心管，加入1 ml分选buffer，10000 g离心1 min，弃上清。加入1 ml分选buffer重复洗涤磁珠1次后用与原来相同体
积的分选buffer重悬磁珠。如吸取30 μl磁珠进行清洗，则清洗后用30 μl分选buffer进行重悬)，混匀后4°C孵育10 min。
注意：如果分选更多细胞，则按比例增加BeaverBeads® Streptavidin用量。例如分选5×107个细胞，在500 μl细胞悬液中加入50 μl Biotin-Antibody Mix和150 μl BeaverBeads® Streptavidin。如果分选少于1×107个细胞，则将细胞悬液体积补至100 μl，加入10 μl Biotin-Antibody Mix和30 μl BeaverBeads® Streptavidin。

4. 孵育完成后，在流式管中加入2.5 ml 分选buffer，用移液器上下混合吹打5次混匀(避免剧烈振荡或者上下颠倒混匀)。

5. 将含有细胞的分选流式管置于磁力架上，静置5 min。

6. 将细胞悬液轻柔倒入一个无菌离心管中(倾倒过程中流式管不要脱离磁力架)，此细胞悬液中即包含纯化的人CD3+ T细胞，300 g，离心5 min。离心后弃上清，收集细胞。
7. 根据实验需要洗涤细胞后，将细胞重悬于所需缓冲液或培养基中，即可用于后续分子生物学或细胞生物学实验。

从人PBMC中分选CD3+ T细胞，分选前 后的细胞用PE anti-human CD3抗体(克 隆号OKT3)标记后进行流式细胞仪分析， 分选前后的CD3+ T细胞纯度分别为 69.1%和97.9%。 

1. 磁珠和抗体混合液使用和保存过程中均应避免冷冻、高速离心等操作；